Recombinant production of GLP-1 analogue using escherichia coli host organism

Abstract

Diabetes is the most serious metabolic disorder correlated with obesity, hypertensionandcardiovascular conditions. High prevalence of Type II Diabetes Mellitus (T2DM) indicatesthe need for new medication development. In developing therapeutics, higher efficiencyand fewer adverse effect features are targeted primarily. Recombinant protein-basedbiotechnological drug molecules have been developed and used for the treatment of T2DM. Especially, GLP-1 analogues are known by their self-limiting mechanismandinsulinotropic effect. In this study, a novel GLP-1 analogue with increased stabilityandefficiency is produced using recombinant E. coli. The expression plasmid was constructedand confirmed by restriction digestion and whole plasmid sequencing. Then, itwastransformed into various E. coli strains followed by optimized lysis, growth and expressionconditions to maximize the yield of the GLP-1 analogue. Various parameters suchas preinduction time, induction point, induction IPTG concentration and post-inductiontemperature were tested for the succesfull expression with maximumyield. Consequently, it was achieved that E. coli BL21(DE3) as strain, 0.2 mM IPTG induction at OD600nmof 0.6and 18 °C overnight post-induction growth was the most promising conditions. Under theseconditions, the GLP-1 analogue was obtained in the insoluble fraction. Followingproteinanalysis and purification, quantification was performed and the highest titer of GLP-1analogue was measured as 626 µg/ml. As future prospect, using another host organismandchanging growth conditions can provide obtaining target protein in the soluble form.

Diyabet, obezite, hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalıklarla ilişkilendirilen enciddi metabolik bozukluktur. Özellikle Tip II Diyabet’in yüksek prevalansı, buna karşı yeni ilaçgeliştirme ihtiyacını işaret etmektedir. Geliştirilen ilaçlarda öncelikle daha yüksekverimlilik ve daha az yan etki hedeflenmektedir. Rekombinant protein temelli biyoteknolojik ilaç molekülleri bu amaç için umut vericidir. Özellikle GLP-1 analogları, kendi kendini sınırlayan mekanizmaları ve insülinotropik etkileriyle bilinmektedir. Buçalışmada, rekombinant E. coli kullanılarak artırılmış stabilite ve verimliliğe sahipyeni birGLP-1 analoğu üretilmiştir. Ekspresyon plazmidi, restriksiyon-ligasyon yöntemi ileoluşturulmuş ve tüm plazmit dizilimi ile doğrulanmıştır. Daha sonra, GLP-1 analoğununverimini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş lizis, büyüme ve ekspresyonkoşulları izlenerek çeşitli E. coli suşlarına transform edilmiştir. Ön indüksiyonsüresi, indüksiyon noktası, indüksiyon IPTG konsantrasyonu ve indüksiyon sonrası sıcaklıkgibi çeşitli parametreler, maksimum verimle başarılı ifade için test edilmiştir. Sonuç olarak, E. coli BL21(DE3) suşu, 0.6 OD600nm'de 0.2 mM IPTG indüksiyonu ve 18 °C'de gece boyuncaindüksiyon sonrası büyümenin en verimli koşullar olduğu sonucuna ulaşıldı. Bukoşullaraltında hedef protein GLP-1 analoğu, çözünmeyen fraksiyon halinde elde edildi. Proteinanalizi ve saflaştırmanın ardından kantifikasyon yapıldı ve GLP-1 analoğunun enyüksektitresi 626 µg/ml olarak ölçüldü. Gelecekteki beklentiler olarak, başka bir konak organizmakullanmak ve büyüme koşullarını değiştirmek, hedef proteinin çözünür formdaeldeedilmesini sağlayabilir.